La microscopía es una técnica importante en numerosas disciplinas, tanto en el ámbito de la investigación como en el comercial. Se utilizan muchas técnicas de microscopía. Entre ellas se encuentran: la microscopía confocal, la de lámina de luz en red y la multifotónica.
En todas estas técnicas, la resolución de la imagen es un factor clave. La resolución desempeña un papel fundamental en el éxito de la microscopía, ya que se refiere a la capacidad del microscopio para captar los detalles de la muestra.
Los avances diarios en estas técnicas ayudan a ampliar aún más los límites de la resolución de imagen, al tiempo que evitan dañar la muestra. Hoy vamos a repasar algunos consejos sobre cómo conseguir imágenes de alta calidad utilizando equipos complementarios, como láseres y tecnología de barrido láser.
Alta potencia, rango de longitudes de onda
Para lograr la máxima resolución, el primer paso es encontrar una fuente láser adecuada. En la microscopía de fluorescencia, los investigadores utilizan colorantes como la cianina, el atto y el azo para identificar la presencia, la posición y la concentración de moléculas específicas. Cada colorante tiene una longitud de onda de excitación máxima, en la que la fluorescencia alcanza su nivel más alto para una potencia de excitación determinada. El uso de un láser cuya longitud de onda se acerque lo más posible a este pico mejora la eficiencia y reduce el calentamiento de la muestra. Esto también aumenta las velocidades de obtención de imágenes alcanzables en aplicaciones de alto rendimiento, o el brillo de la imagen en aplicaciones con poca luz.
En la microscopía de agotamiento por emisión estimulada (STED), las imágenes de superresolución —es decir, aquellas que superan la resolución limitada por difracción— se generan empleando un segundo láser para desactivar selectivamente los fluoróforos cercanos al punto focal del láser de excitación. Esto minimiza el área iluminada hasta un tamaño muy inferior al del punto del láser de excitación. De este modo, aumenta la resolución que se puede alcanzar.
El nivel de potencia del láser necesario para la microscopía depende de muchos factores. Entre ellos se incluyen el tamaño del área de la muestra, el tipo de muestra, la velocidad de captura de imágenes requerida y la técnica de microscopía empleada. Encontrar el equilibrio adecuado entre el brillo de la imagen y la vida útil de la muestra puede resultar complicado. Disponer de una amplia gama de potencias máximas y la capacidad de variar de forma continua la potencia por debajo de ese máximo es una herramienta fundamental para optimizar su configuración.
Imágenes de alta velocidad
Otros factores clave a tener en cuenta, más allá del tipo de láser y las longitudes de onda, están relacionados con la solución de barrido. Es importante elegir una solución de barrido que permita la frecuencia de fotogramas y el campo de visión deseados gracias a su velocidad de barrido y al ángulo de los componentes de orientación del haz. Por eso, la selección de los componentes de orientación del haz adecuados es fundamental para el desarrollo de cada sistema de microscopía. Cambridge Technology ofrece componentes de orientación del haz, como galvanómetros y escáneres resonantes, muy valorados en el campo de la microscopía tanto por su rendimiento como por su fiabilidad a largo plazo.
Los galvanómetros han sido la opción más habitual debido a su control preciso de la velocidad y la posición. Esto proporciona la flexibilidad necesaria para ajustar la frecuencia y los patrones de barrido según la técnica de microscopía empleada.
Con los avances en las ciencias de la vida y la necesidad de observar movimientos rápidos y morfologías dentro de las células y los tejidos, se requieren velocidades de barrido aún mayores para la obtención de imágenes in vivo. Esto es posible gracias anuestro escáner resonante CRS. El CRS oscila a una frecuencia resonante fija más de 10 veces más rápida que los galvanómetros estándar. Aunque ofrece menos flexibilidad en cuanto a la variedad de tipos de barrido, la optimización del CRS para el barrido de alta velocidad permite que los sistemas de microscopía alcancen más de cientos de fotogramas por segundo.
Punto focal muy concentrado
Otro aspecto a tener en cuenta para mejorar la resolución es el tamaño del punto focal del láser.Un láser TEM00con un enfoque muy preciso y unM2cercano a la unidad puede enfocarse hasta alcanzar un tamaño de punto que se aproxima al límite de difracción de unos pocos cientos de nanómetros (dependiendo de la longitud de onda y la apertura numérica), con un perfil de intensidad gaussiano fácil de modelar, lo que permite la máxima resolución de imagen posible y una interpretación sencilla de los resultados. Un punto focal bien definido también permite un escaneo punto a punto de la imagen con gran precisión, lo que, una vez más, conduce a una mejor resolución.
De manera similar, en la microscopía de dos fotones, la excitación de la muestra se basa en el proceso de absorción de dos fotones, que depende de la intensidad. La absorción de dos fotones está altamente localizada en la región focal del haz de excitación, por lo que lograr un área focal estrecha mediante la selección de un láser de excitación con un M2 cercano a la unidad permite generar imágenes con la máxima resolución.
Fácil integración gracias a su larga vida útil y su tamaño compacto
Al igual que con cualquier sistema, la fácil integración y la larga vida útil son imprescindibles. En microscopía, debido al reducido espacio disponible en el sector, disponer de una solución de tamaño compacto también es imprescindible. Un láser y una solución de barrido láser que puedan cumplir todos estos requisitos contribuirán al rendimiento general del sistema, lo que incluye la obtención de imágenes de alta calidad durante un largo periodo de tiempo.
Por ejemplo,los láseres de Laser Quantum tienen un tiempo medio entre fallos (MTTF)que supera las 400 000 horas de uso. La tecnología de escaneo láser de Cambridge Technology también ofrece fiabilidad con vidas útiles extremadamente largas para una gran variedad de entornos.
Si a esto se le añade una tecnología de tamaño compacto y adaptable, los usuarios podrán lograr una fácil integración en los equipos de los fabricantes de equipos originales (OEM), satisfaciendo así esa importante demanda de compatibilidad y facilidad de uso.
