La microscopia è una tecnica importante in numerose discipline, sia nel campo della ricerca che in quello commerciale. Esistono molte tecniche di microscopia in uso. Alcune di queste includono: la microscopia confocale a ponte, la microscopia a foglio di luce reticolare e la microscopia multifotonica.
Per tutte queste tecniche, la risoluzione dell’immagine è un fattore chiave. La risoluzione gioca un ruolo fondamentale nel successo della microscopia, poiché si riferisce alla capacità del microscopio di cogliere i dettagli del campione.
I progressi quotidiani in queste tecniche contribuiscono a spingere ulteriormente i limiti della risoluzione dell’immagine, evitando al contempo di danneggiare il campione. Oggi esamineremo alcuni suggerimenti su come ottenere immagini di alta qualità utilizzando apparecchiature di supporto quali i laser e la tecnologia di scansione laser.
Elevata potenza, ampia gamma di lunghezze d’onda
Per ottenere la massima risoluzione, il primo passo consiste nell’individuare una sorgente laser adeguata. Nella microscopia a fluorescenza, i ricercatori utilizzano coloranti quali cianina, atto e azo per identificare la presenza, la posizione e la concentrazione di molecole specifiche. Ogni colorante presenta una lunghezza d’onda di eccitazione di picco, in cui la fluorescenza raggiunge il massimo per una data potenza di eccitazione. L’utilizzo di un laser il più possibile in linea con questa lunghezza d’onda di picco migliora l’efficienza, riducendo il riscaldamento del campione. Ciò aumenta anche le velocità di acquisizione delle immagini raggiungibili nelle applicazioni ad alta produttività, oppure la luminosità dell’immagine in condizioni di scarsa illuminazione.
Nella microscopia a esaurimento dell’emissione stimolata (STED), le immagini a super-risoluzione, ovvero immagini che superano la risoluzione limitata dalla diffrazione, vengono generate impiegando un secondo laser per disattivare selettivamente i fluorofori vicini al punto focale del laser di eccitazione. Ciò riduce al minimo l’area illuminata, portandola ben al di sotto della dimensione dello spot del laser di eccitazione. Ciò aumenta la risoluzione ottenibile.
Il livello di potenza laser richiesto per la microscopia dipende da molti fattori. Tra questi figurano le dimensioni dell’area del campione, il tipo di campione, la velocità di acquisizione richiesta e la tecnica microscopica impiegata. Trovare il giusto equilibrio tra luminosità dell’immagine e durata del campione può risultare impegnativo. L’accesso a un’ampia gamma di potenze massime e la possibilità di variare continuamente la potenza al di sotto di tale valore massimo sono strumenti fondamentali per ottimizzare la propria configurazione.
Acquisizione di immagini ad alta velocità
Altri fattori chiave da considerare, oltre al tipo di laser e alle lunghezze d’onda, riguardano la soluzione di scansione. È importante scegliere una soluzione di scansione che consenta di ottenere la frequenza dei fotogrammi e il campo visivo desiderati grazie alla velocità di scansione e all’angolo dei componenti di orientamento del fascio. Ecco perché la scelta dei giusti componenti di orientamento del fascio è fondamentale per lo sviluppo di ogni sistema di microscopia. Cambridge Technology offre componenti di orientamento del raggio, quali galvanometri e scanner risonanti, molto apprezzati nel campo della microscopia sia per le prestazioni che per l’affidabilità a lungo termine.
I galvanometri sono da sempre la scelta più diffusa grazie al loro controllo preciso della velocità e della posizione. Ciò offre la flessibilità necessaria per regolare la frequenza e gli schemi di scansione in base alla tecnica microscopica impiegata.
Con il progresso delle scienze della vita e la necessità di osservare movimenti rapidi e morfologie all’interno di cellule e tessuti, per l’imaging in vivo sono auspicabili velocità di scansione ancora più elevate. Ciò è reso possibile dalnostro scanner risonante CRS. Il CRS oscilla a una frequenza risonante fissa, più di 10 volte più veloce rispetto ai galvanometri standard. Sebbene meno flessibile nella varietà dei tipi di scansione, l’ottimizzazione del CRS per la scansione ad alta velocità consente ai sistemi di microscopia di raggiungere oltre centinaia di fotogrammi al secondo.
Punto focale strettamente concentrato
Un altro aspetto da considerare per migliorare la risoluzione è la dimensione del punto focale del laser.Un laser TEM00altamente focalizzato con unM2vicino all’unità può essere focalizzato su una dimensione del punto che si avvicina al limite di diffrazione di poche centinaia di nanometri (a seconda della lunghezza d’onda e dell’apertura numerica), con un profilo di intensità gaussiano facilmente modellabile, consentendo la massima risoluzione dell’immagine possibile e una semplice interpretazione dei risultati. Un punto focale ben concentrato consente inoltre una scansione punto a punto dell’immagine ad alta precisione, portando ancora una volta a una risoluzione migliorata.
Analogamente, nella microscopia a due fotoni, l’eccitazione del campione si basa sul processo di assorbimento a due fotoni, che dipende dall’intensità. L’assorbimento a due fotoni è altamente localizzato nella regione focale del fascio di eccitazione; pertanto, ottenere un’area focale ristretta attraverso la scelta di un laser di eccitazione con un M2 vicino all’unità consente di generare immagini con la massima risoluzione.
Facile integrazione grazie alla lunga durata operativa e alle dimensioni compatte
Come per qualsiasi sistema, la facilità di integrazione e la lunga durata operativa sono requisiti imprescindibili. Nella microscopia, data l’ingombro ridotto tipico del settore, è indispensabile disporre di una soluzione dalle dimensioni compatte. Un laser e una soluzione di scansione laser in grado di soddisfare tutti questi requisiti contribuiranno alle prestazioni complessive del sistema, compreso il raggiungimento di immagini di alta qualità per un lungo periodo di tempo.
Ad esempio,i laser di Laser Quantum presentano un tempo medio tra i guasti (MTTF)che supera in media le 400.000 ore di utilizzo. Anche la tecnologia di scansione laser di Cambridge Technology offre affidabilità con durate estremamente lunghe in una varietà di ambienti.
Aggiungendo una tecnologia dalle dimensioni compatte e dall’elevata adattabilità, gli utenti potranno ottenere una facile integrazione nelle apparecchiature OEM, soddisfacendo così l’importante esigenza di compatibilità e facilità d’uso.
